Употреба и предпазни мерки на ултрафилтрационна центрофужна епруветка
1) Изберете подходяща ултрафилтрационна тръба.Обърнете внимание, че UF мембраните се различават по нивото на поносимост към различни химикали.Обикновено епруветките за ултрафилтрация с граница на молекулното тегло от 10 kDa могат да бъдат избрани с граница на молекулното тегло, която не трябва да бъде по-голяма от 1/3 от молекулното тегло на интересуващия ни протеин, като например 35 kDa.Ако молекулното тегло на протеина, който представлява интерес, е около 10 kd, може да се използва епруветка за ултрафилтрация с граница на молекулното тегло от 3 kD.
(2) Ултрафилтрацията, прясно закупена, е суха, с добавена ултрачиста вода преди употреба и водата е напълно преминала през мембраната, ледената баня или хладилника, предварително охладена за няколко минути.След това водата се излива, т.е. протеиновата течност, и колко се добавя, което не е повече от бялата линия в горната част на епруветката.Операцията е лека и ултрафилтрационната тръба трябва да бъде предварително охладена върху лед, преди да се добави протеиновият разтвор.
3) И масата, и центърът на тежестта трябваше да достигнат баланса.Имайте предвид, че скоростта на въртене и ускорението не са много бързи, в противен случай директно увреждат ултрафилтрационната мембрана.Стартира се центрофужна ултрафилтрация (центрофугата е предварително охладена до 4 градуса).След като RPM на различни центрофуги беше преобразувана в g, тя беше различна.Ускорението на центрофугата се регулира до минимум, намалявайки налягането върху мембраната.Забележете, не забравяйте да напуснете центрофугата, след като центрофугата достигне целевата си скорост или ако имате проблем, не можете да се справите с него за първи път.Ориентацията на мембраната към шпиндела беше регулирана съгласно инструкциите (ъгловият корпус на центрофугата е мембраната перпендикулярна на оста).При практическа употреба общата скорост на въртене е по-ниска от тази в инструкциите, така че животът на центрофужната тръба може да бъде удължен.
3) И масата, и центърът на тежестта трябваше да достигнат баланса.Имайте предвид, че скоростта на въртене и ускорението не са много бързи, в противен случай директно увреждат ултрафилтрационната мембрана.Стартира се центрофужна ултрафилтрация (центрофугата е предварително охладена до 4 градуса).След като RPM на различни центрофуги беше преобразувана в g, тя беше различна.Ускорението на центрофугата се регулира до минимум, намалявайки налягането върху мембраната.Забележете, не забравяйте да напуснете центрофугата, след като центрофугата достигне целевата си скорост или ако имате проблем, не можете да се справите с него за първи път.Ориентацията на мембраната спрямо шпиндела се регулира съгласно инструкциите (ъгловият корпус на центрофугата е мембраната перпендикулярна на оста).При практическа употреба общата скорост на въртене е по-ниска от тази в инструкциите, така че животът на центрофужната тръба може да бъде удължен.
(4) Когато се концентрира до оставащия 1 ml, вземете 50 ul буферен разтвор, добавете 10 ul поток и вижте дали има някакъв син цвят, за да прецените дали в епруветката за ултрафилтрация липсва протеин.Ако тръбата е спукана, изсипете отново горния слой и прекарайте в нова тръба, за да започнете ултрафилтрация.За да определите точно дали епруветките са пропуснати, центрофугирайте за 10 минути с 5 mgml BSA преди преминаване, протичане на протеиново лепило или суров анализ на Брадфорд и продължете с добавяне на останалия концентриран протеинов разтвор (който работи върху лед и предотвратява нагряването на протеините), докато целият концентрат е добавен.Внимавайте по време на центрофугирането, ако настъпи утаяване на протеини, водещо до затваряне на епруветката.Ако настъпи утаяване, определете дали конкретната причина за утаяването е прекомерна концентрация на протеин или неподходящ буфер;Първият може да бъде решен чрез ултрафилтрация на множество ултрафилтрационни епруветки едновременно, намалявайки концентрацията, а вторият чрез обмен на различни буферни разтвори, докато не настъпи утаяване на протеина.
(4) Когато се концентрира до оставащия 1 ml, вземете 50 ul буферен разтвор, добавете 10 ul поток и вижте дали има някакъв син цвят, за да прецените дали в епруветката за ултрафилтрация липсва протеин.Ако тръбата е спукана, изсипете отново горния слой и прекарайте в нова тръба, за да започнете ултрафилтрация.За да определите точно дали епруветките са пропуснати, центрофугирайте за 10 минути с 5 mgml BSA преди преминаване, протичане на протеиново лепило или суров анализ на Брадфорд и продължете с добавяне на останалия концентриран протеинов разтвор (който работи върху лед и предотвратява нагряването на протеините), докато целият концентрат е добавен.Внимавайте по време на центрофугирането, ако настъпи утаяване на протеини, водещо до затваряне на епруветката.Ако настъпи утаяване, определете дали конкретната причина за утаяването е прекомерна концентрация на протеин или неподходящ буфер;Първият може да бъде решен чрез ултрафилтрация на множество ултрафилтрационни епруветки едновременно, намалявайки концентрацията, а вторият чрез обмен на различни буферни разтвори, докато не настъпи утаяване на протеина.
(5) Първите няколко стъпки се използват за концентриране на протеина и ако буферът трябва да се промени, внимателно добавете нов буфер (ултрафилтрация през 0,22 um ултрафилтрационна мембрана) към около 1 ml от общия протеин и повторно концентрирайте до около 1 ml за три последователни пъти, като крайният концентриран краен обем зависи от желаната протеинова концентрация, обикновено не повече от 500 ul, но също и до 200 ul.Постигнете 1000 × или повече при три случая, по същество толкова промяна на буфера, колкото е изчислено чрез поне 10 × или повече обемно обогатяване всеки път.
(5) Първите няколко стъпки се използват за концентриране на протеина и ако буферът трябва да се промени, внимателно добавете нов буфер (ултрафилтрация през 0,22 um ултрафилтрационна мембрана) към около 1 ml от общия протеин и повторно концентрирайте до около 1 ml за три последователни пъти, като крайният концентриран краен обем зависи от желаната протеинова концентрация, обикновено не повече от 500 ul, но също и до 200 ul.Постигнете 1000 × или повече при три случая, по същество толкова промяна на буфера, колкото е изчислено чрез поне 10 × или повече обемно обогатяване всеки път.
Време на публикуване: 09 ноември 2022 г