PCR, е полимеразната верижна реакция, която се отнася до добавянето на dNTP, Mg2+, фактори на елонгация и фактори на усилване на амплификацията към системата под катализа на ДНК полимераза, използвайки родителската ДНК като шаблон и специфични праймери като начална точка на удължаване, Чрез стъпките на денатурация, отгряване, удължаване и т.н., процесът на in vitro репликация на дъщерна верига ДНК, комплементарна на матричната ДНК на родителската верига, може бързо и специфично да амплифицира всяка целева ДНК in vitro.
1. PCR с горещ старт
Началното време на амплификацията при конвенционалната PCR не е да поставите PCR машината в PCR машината и след това програмата започва да амплифицира.Когато конфигурацията на системата приключи, амплификацията започва, което може да причини неспецифична амплификация и PCR с горещ старт може да реши този проблем.
Какво е PCR с горещ старт?След като реакционната система е подготвена, ензимният модификатор се освобождава при висока температура (обикновено по-висока от 90°C) по време на началния етап на нагряване на реакцията или етапа на „горещ старт“, така че ДНК полимеразата се активира.Точното време и температура на активиране зависят от природата на ДНК полимеразата и модификатора за горещ старт.Този метод използва главно модификатори като антитела, афинитетни лиганди или химични модификатори за инхибиране на активността на ДНК полимеразата.Тъй като активността на ДНК полимеразата се инхибира при стайна температура, технологията за горещ старт осигурява голямо удобство за приготвяне на множество PCR реакционни системи при стайна температура, без да се жертва специфичността на PCR реакциите.
2. RT-PCR
RT-PCR (PCR с обратна транскрипция) е експериментална техника за обратна транскрипция от иРНК в сДНК и използването й като шаблон за амплификация.Експерименталната процедура е първо да се извлече тотална РНК в тъкани или клетки, да се използва Oligo (dT) като праймер, да се използва обратна транскриптаза за синтезиране на cDNA и след това да се използва cDNA като шаблон за PCR амплификация за получаване на целевия ген или откриване на генна експресия.
3. Флуоресцентна количествена PCR
Флуоресцентна количествена PCR (количествена PCR в реално време,RT-qPCR) се отнася до метода за добавяне на флуоресцентни групи към PCR реакционната система, като се използва натрупването на флуоресцентни сигнали за наблюдение на целия PCR процес в реално време и накрая се използва стандартната крива за количествен анализ на шаблона.Често използваните qPCR методи включват SYBR Green I и TaqMan.
4. Вложен PCR
Вложената PCR се отнася до използването на два набора от PCR праймери за два кръга на PCR амплификация, а продуктът на амплификация от втория кръг е целевият генен фрагмент.
Ако несъответствие на първата двойка праймери (външни праймери) причини амплифициране на неспецифичен продукт, възможността същата неспецифична област да бъде разпозната от втората двойка праймери и да продължи да се амплифицира е много малка, така че амплификация от втората двойка праймери, специфичността на PCR е подобрена.Едно предимство на извършването на два кръга на PCR е, че помага да се усили достатъчен продукт от ограничена изходна ДНК.
5. Тъчдаун PCR
Touchdown PCR е метод за подобряване на специфичността на PCR реакцията чрез регулиране на параметрите на PCR цикъла.
При тъчдаун PCR, температурата на отгряване за първите няколко цикъла се задава с няколко градуса над максималната температура на отгряване (Tm) на праймерите.По-високата температура на отгряване може ефективно да намали неспецифичната амплификация, но в същото време по-високата температура на отгряване ще влоши разделянето на праймерите и целевите последователности, което води до намален добив на PCR.Следователно, в първите няколко цикъла, температурата на отгряване обикновено се настройва да намалява с 1°C на цикъл, за да се увеличи съдържанието на целевия ген в системата.Когато температурата на отгряване се понижи до оптималната температура, температурата на отгряване се поддържа за останалите цикли.
6. Директен PCR
Директната PCR се отнася до амплификацията на целевата ДНК директно от пробата без необходимост от изолиране и пречистване на нуклеинова киселина.
Има два вида директен PCR:
директен метод: вземете малко количество проба и я добавете директно към PCR Master Mix за PCR идентификация;
метод на крекинг: след вземане на проба от пробата, добавете я към лизата, лизирайте, за да освободите генома, вземете малко количество от лизирания супернатант и го добавете към PCR Master Mix, извършете PCR идентификация.Този подход опростява експерименталния работен процес, намалява времето за работа и избягва загубата на ДНК по време на стъпките на пречистване.
7. SOE PCR
Сплайсинг на ген чрез удължаване на припокриване PCR (SOE PCR) използва праймери с допълващи се краища, за да накара PCR продуктите да образуват припокриващи се вериги, така че в последващата реакция на амплификация, чрез удължаване на припокриващите се вериги, различни източници на техника, при която амплифицираните фрагменти се припокриват и съединени заедно.Тази технология в момента има две основни направления на приложение: конструиране на слети гени;сайт-насочена мутация на ген.
8. IPCR
Инверсна PCR (IPCR) използва обратни комплементарни праймери за амплифициране на ДНК фрагменти, различни от двата праймера, и амплифицира неизвестни последователности от двете страни на известен ДНК фрагмент.
IPCR първоначално е проектиран да определя последователността на съседни неизвестни региони и се използва най-вече за изследване на генни промоторни последователности;онкогенни хромозомни пренареждания, като генно сливане, транслокация и транспозиция;и интегриране на вирусен ген, също често се използват сега. За сайт-насочена мутагенеза копирайте плазмид с желаната мутация.
9. dPCR
Дигиталната PCR (dPCR) е техника за абсолютно количествено определяне на молекулите на нуклеинова киселина.
Понастоящем има три метода за количествено определяне на молекулите на нуклеинова киселина.Фотометрията се основава на абсорбцията на молекулите на нуклеиновата киселина;флуоресцентната количествена PCR в реално време (PCR в реално време) се основава на стойността на Ct, а стойността на Ct се отнася до номера на цикъла, съответстващ на стойността на флуоресценцията, която може да бъде открита;дигиталната PCR е най-новата количествена технология, базирана на едномолекулен PCR метод за преброяване на нуклеинова киселина, количественото определяне е абсолютен количествен метод.
Време на публикуване: 13 юни 2023 г